《保健食品原料目录螺旋藻》及原料技术要求

时间： 2022-03-01 作者：来源：

导读： 《保健食品原料目录螺旋藻》原料名称每日用量功效名称用量范围适宜人群不适宜人群注意事项螺旋藻3-4g免疫

《保健食品原料目录螺旋藻》

原料名称

每日用量

功效

名称

用量范围

适宜人群

不适宜人群

注意事项

螺旋藻

3-4g

免疫力低下者

婴幼儿、孕妇及乳母、过敏体质人群

增强

免疫力

螺旋藻原料技术要求

【来源】

螺旋藻为钝顶螺旋藻（Arthrospira platensis）和极大螺旋藻（Arthrospira maxima）经人工培养、采收、清洗的藻泥，经过喷雾干燥，或者其他干燥方法并经杀菌获得的干粉。

【感官要求】

应符合表1规定。

表1 感官指标

项目	要求
色泽	蓝绿色至墨绿色
滋味、气味	无异味，略带藻腥味
状态	均匀干燥疏松粉末，无结块，无正常视力可见外来杂质

【鉴别】

取少量样品于水中，充分震荡搅拌使藻粉颗粒分散，显微镜视野中应呈分散、绿色的S形、L形、C形或螺旋形的藻丝体，不得有明显异物。

【理化指标】

应符合表2规定。

表2 理化指标

项目	指标	检验方法
水分，% ≤	7.0	GB 5009.3第一法
总灰分，% ≤	7.0	GB 5009.4
蛋白质，％ ≥	55.0	GB 5009.5
铅（以Pb计）， mg/kg ≤	2.0	GB 5009.12
砷（以As计）， mg/kg ≤	1.0	GB 5009.11
汞（以Hg计）， mg/kg ≤	0.3	GB 5009.17
镉（以Cd计）， mg/kg ≤	0.2	GB 5009.15

【微生物指标】

应符合表3规定。

表3 微生物指标

项目	指标				检验方法
菌落总数，CFU/g ≤	30000				GB 4789.2
霉菌和酵母，CFU/g ≤	50				GB 4789.15
大肠菌群，MPN/g ≤	0.92				GB 4789.3 MPN计数法
沙门氏菌≤	0/25g				GB 4789.4
金黄色葡萄球菌≤	0/25g				GB 4789.10
副溶血性弧菌，MPN/g	采样量为25g				GB/T 4789.7
	n	c	m	M
	5	1	100 MPN/g	1000 MPN/g

注：n为同一批次产品应采集的样品件数；c为最大可允许超出m值的样品数；m为致病菌指标可接受水平的限量值；M为致病菌指标的最高安全限量值。

【标志性成分指标】

应符合表4规定。

表4标志性成分指标

项目	指标	检验方法
β-胡萝卜素，g/kg≥	0.20	1β-胡萝卜素的测定
藻蓝蛋白，%≥	5.00	2藻蓝蛋白的测定

1β-胡萝卜素的测定

1.1试剂和材料

1.1.1氢氧化钾溶液:称固体氢氧化钾500g,加入500mL水溶解。临用前配制。

1.1.2无水硫酸钠(Na₂SO₄)，分析纯

1.1.3抗坏血酸(C₆H₈O₆)，分析纯

1.1.4石油醚：沸程30℃~60℃，分析纯

1.1.5甲醇(CH₄O)，色谱纯

1.1.6乙腈(C₂H₃N)，色谱纯

1.1.7甲基叔丁基醚[CH₃OC(CH₃)₃]，色谱纯

1.1.8二氯甲烷(CH₂Cl₂)，色谱纯

1.1.9 无水乙醇(C₂H₆O)，优级纯

1.1.10 水，符合GB/T6682规定的一级水

1.1.11 碘溶液(I₂):0.5 mol/L浓度

1.1.12 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(C₁₅H₂₄O，BHT)

1.2 仪器和设备

1.2.1匀浆机

1.2.2 高速粉碎机

1.2.3恒温振荡水浴箱（控温精度±1℃）

1.2.4旋转蒸发器

1.2.5氮吹仪

1.2.6紫外-可见光分光光度计

1.2.7高效液相色谱仪(带紫外检测器)

1.3 对照品溶液制备

1.3.1 β-胡萝卜素标准储备液(500μg/mL)

准确称取β-胡萝卜素标准品25mg(精确到0.1mg)，加入0.125gBHT，用二氯甲烷溶解，转移至50mL棕色容量瓶中定容至刻度。

1.3.2β-胡萝卜素标准中间液(100 μg/mL)

从β-胡萝卜素标准储备液中准确移取10.0 mL溶液于50mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度。

1.3.3 β-胡萝卜素标准工作液

从β-胡萝卜素标准中间液中分别准确移取0.50 mL、1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、10.00 mL溶液至6个100 mL棕色容量瓶。用二氯甲烷定容至刻度，得到浓度为0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、4.0 μg/mL、10 μg/mL的系列标准工作液。

1.3.4 碘乙醇溶液(0.05mol/L)

吸取5mL碘溶液,用乙醇稀释至50mL,混匀。

1.3.5 异构化β-胡萝卜素溶液

取10 mLβ-胡萝卜素标准储备液于烧杯中，加入20 μL碘乙醇溶液，摇匀后于日光下或距离40 W日光灯30 cm处照射15 min，用二氯甲烷稀释至50 mL。摇匀后过0.45 μm滤膜，备HPLC色谱分析用。

1.4供试品溶液制备

1.4.1 预处理

精确称取1g~5g (精确至0.001g)螺旋藻粉，转至250mL锥形瓶中，加入1g抗坏血酸、75mL无水乙醇，于60℃±1℃水浴振荡30min。

1.4.2 皂化

加入25mL氢氧化钾溶液，盖上瓶塞。置于已预热至53℃±2℃恒温振荡水浴箱中，皂化30min。取出，静置，冷却到室温。

1.4.3 试样萃取

将皂化液转入500mL分液漏斗中，加入100mL石油醚，轻轻摇动，排气，盖好瓶塞，室温下振荡，10min后静置分层，将水相转入另一分液漏斗中按上述方法进行第二次提取。合并有机相，用水洗至近中性。弃水相，有机相通过无水硫酸钠过滤脱水。滤液收入500mL蒸发瓶中，于旋转蒸发器上40℃±2℃减压浓缩，近干。用氮气吹干，用移液管准确加入5.0mL二氯甲烷，盖上瓶塞，充分溶解提取物。经0.45 μm膜过滤后，弃出初始约1mL滤液后收集至进样瓶中，备用。

1.5色谱条件

a) 色谱柱：C30柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm，或等效柱；

b) 流动相：A相：甲醇:乙腈:水=73.5:24.5:2；

B相：甲基叔丁基醚；

表5 梯度程序

时间/min	0	15	18	19	20	22
A%	100	59	20	20	0	100
B%	0	41	80	80	100	0

c) 流速：1.0mL/min；

d) 检测波长：450nm；

e) 柱温：30 ℃±1 ℃；

f) 进样体积：20μL。

1.6 测定

在相同色谱条件下,将待测液注入液相色谱仪中,以保留时间定性,根据峰面积采用外标法定量,β-胡萝卜素根据全反式β-胡萝卜素响应因子进行计算。

1.7 全反式β-胡萝卜素色谱纯度的计算

1.7.1 β-胡萝卜素异构体保留时间的确认

分别取β-胡萝卜素标准中间液(100 μg/mL)和异构化β-胡萝卜素溶液,按照色谱条件注入HPLC仪进行色谱分析。根据β-胡萝卜素标准中间液的色谱图确认全反式β-胡萝卜素的保留时间；对比β-胡萝卜素标准中间液和异构化β-胡萝卜素溶液色谱图中各峰面积变化，以及与全反式β-胡萝卜素的位置关系确认顺式β-胡萝卜素异构体的保留时间：全反式β-胡萝卜素前较大的色谱峰为13-顺式-β-胡萝卜素，紧邻全反式β-胡萝卜素后较大的色谱峰为9-顺式-β-胡萝卜素，13-顺式-β-胡萝卜素前是15-顺式-β-胡萝卜素，另外可能还有其他较小的顺式结构色谱峰，色谱图见图。

1.7.2 全反式β反胡萝卜素标准液色谱纯度的计算

取β-胡萝卜素标准工作液(3 μg/mL),按照色谱条件进行HPLC分析,重复进样6次。计算全反式β-胡萝卜素色谱峰的峰面积、全反式与上述各顺式结构的峰面积总和,全反式β-胡萝卜素色谱纯度（CP）按公式计算。

CP———全反式β-胡萝卜素色谱纯度，%；

Ᾱ_all-E———全反式β-胡萝卜素色谱峰峰面积平均值，单位为峰面积(AU)；

Ᾱ_sum———全反式β-胡萝卜素及各顺式结构峰面积总和平均值,单位为峰面积(AU)。

1.8 结果计算

计算全反式β-胡萝卜素响应因子

将β-胡萝卜素混合标准工作液注入HPLC仪中(色谱图见图1),根据保留时间定性,测定β-胡萝卜素各异构体峰面积。

β-胡萝卜素根据标准工作液标定浓度、全反式β-胡萝卜素6次测定峰面积平均值、全反式β-胡萝卜素色谱纯度（CP）,按公式计算全反式β-胡萝卜素响应因子。

式中:

RF ———全反式β-胡萝卜素响应因子,单位为峰面积毫升每微克(AU·mL/μg)；

Ᾱ_all-E ———全反式β-胡萝卜素标准工作液色谱峰峰面积平均值，单位为峰面积(AU)；

ρ ———β-胡萝卜素标准工作液标定浓度,单位为微克每毫升(μg/mL)；

CP ———全反式β-胡萝卜素的色谱纯度，%。

试样中β-胡萝卜素含量按下公式计算:

式中:

X_β ———试样中β-胡萝卜素的含量,单位为微克每百克(μg/100g);

A_all-E ———试样待测液中全反式β-胡萝卜素峰面积,单位为峰面积(AU);

A_9Z———试样待测液中9-顺式-β-胡萝卜素的峰面积,单位为峰面积(AU);

A_13Z ———试样待测液中13-顺式-β-胡萝卜素的峰面积,单位为峰面积(AU);

1.2 ———13-顺式-β-胡萝卜素的相对校正因子;

A_15Z ———试样待测液中15-顺式-β-胡萝卜素的峰面积,单位为峰面积(AU);

1.4 ———15-顺式-β-胡萝卜素的相对校正因子;

A_xZ ———试样待测液中其他顺式β-胡萝卜素的峰面积,单位为峰面积(AU);

V ———试样液定容体积,单位为毫升(mL);

100 ———将结果表示为微克每百克(μg/100g)的系数;

RF ———全反式β-胡萝卜素响应因子,单位为峰面积毫升每微克(AU·mL/μg);

m ———试样质量,单位为克(g)。

注1:由于β-胡萝卜素各异构体百分吸光系数不同(见附录D),所以在β-胡萝卜素计算过程中,需采用相对校正因子对结果进行校正。

注2:如果试样中其他顺式β-胡萝卜素含量较低,可不进行计算。

1.9 色谱图

图1 β-胡萝卜素检测色谱图

说明：

Ⅰ——15-顺式-β-胡萝卜素；

Ⅱ——13-顺式-β-胡萝卜素；

Ⅲ——全反式α-胡萝卜素；

Ⅳ——全反式β-胡萝卜素；

Ⅴ——9-顺式-β-胡萝卜素。

2 藻蓝蛋白的测定

2.1试剂

磷酸盐缓冲溶液:将0.1 mol/L磷酸二氢钾溶液与0.1 mol/L磷酸氢二钾溶液(45+55V/V) 混合，溶液pH值为7.0。

2.2仪器和设备

2.2.1 分光光度计

2.2.2 超声波振荡器

2.2.3 离心机（3000 r/min）

2.2.4 低温冰箱（-20 ℃）

2.2.5 离心管（50 mL）。

2.3供试品溶液制备

称取试样0.25-0.5g（精确至0.0001g）。用缓冲液（2.1项）溶解，超声振荡5 min.定容于250 mL容量瓶中，摇匀。将溶液全部转入250 mL广口塑料瓶，置于-20℃冰箱内冷冻12h(或放置过夜)。取出解冻，摇匀。

2.4 测定

取部分溶液于离心管中，在3000r/min转速下离心15min取上层清液.1 cm比色皿，在分光光度计上分别测定620 nm、652 nm、562 nm处的吸光度，用缓冲液(2.1项)做空白。

2.5 结果计算

X₁——测试液中藻蓝素的含量，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

X₂——测试液中异藻蓝素的含量，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

X₃——测试液中藻红素的含量，单位为毫克每毫升(mg/mL)；

A——相应波长处(620nm,652nm,562nm)测得吸光值；

X₄——试样中藻蓝蛋白的质量分数，单位为克每100克(g/100g)；

V——样品定容体积，单位为毫升(mL)。

m——试样质量，单位为克(g)。

测定结果取平行试验结果的算术平均值，保留小数点后第二位。

平行试验允许误差(相对)不大于4%。

注2 整个操作过程须注意避光，分光光度测定应在15 min 内完成。

【储存】包装应密封、牢固、防潮、不易破损，贮藏在遮荫、干燥、通风的库房内

【产品的剂型】片剂、颗粒剂、硬胶囊

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