3.6小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验

    可任选下列方法之一。

3.6.1小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）

3.6.1.1原理：本方法是利用巨噬细胞对光滑表面如玻璃表面具有粘附的特性，将含有巨噬细胞的腹腔液滴于载玻片上，加入鸡红细胞，孵育一定时间后，冲洗掉无粘附力或粘附力差的细胞，固定染色，，获得以巨噬细胞为主的标本，在显微镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的百分比和吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬能力。

3.6.1.2仪器和材料:

显微镜、37℃孵箱、计数器、手术器械一套、注射器、滴管、胶头吸管、吸耳球、载玻片、染色槽、试管

3.6.1.2.1玻片处理：重复使用的载玻片要经洗液浸泡、洗净晾干后，经酒精浸泡过夜。用前以纱布拭干或晾干，否则会影响巨噬细胞粘附和镜检。在玻片上标号，用3％琼脂（配方见试剂部分）每个玻片上划两个圆圈（圆圈必须全封闭，否则液体会流出），晾干备用。

3.6.1.2.2搪瓷或塑料盒：内垫半湿纱布（用温水湿透，置于孵箱内备用），纱布一定要平整。

3.6.1.2.3试剂配制方法

3.6.1.2.4.1 Hank's液:参照

3.6.1.2.5 PBS缓冲液的配制方法：

KH₂PO₄ 6.66g，Na₂HPO₄·12H₂O 6.38g，将上述试剂溶于1000mL蒸馏水中调PH值至6.8即成。

3.6.1.2.6 1％鸡红细胞悬液：

实验前取鸡颈静脉或动脉血，置于盛有玻璃珠（20个左右）的三角瓶内，连续顺一个方向充分摇动5～10分钟，除去纤维蛋白，4℃冰箱保存。实验前用生理盐水洗涤3次，每次1500rPm，离心10分钟，弃去上清，按血球压积用Hank’s液配制成1％的红细胞悬液。

3.6.1.2.7 Giemsa染液：

a. 取Giemsa染料0.5g，中性甘油33mL，甲醇33mL。先将Giemsa染料置清洁研钵中，加甘油后，研磨片刻，倒入棕色瓶内，放置55～60℃水浴箱内2小时，不断摇匀, 再加入甲醇摇匀，保存备用。

b.稀释姬姆萨氏染色液：使用时，用pH6.8的缓冲液8份，加姬姆萨氏染色液原液1份，即成应用液。

3.6.1.2.8 Giemsa染液脱色液：配制方法：甲醇20mL,蒸馏水80mL。混合后加2N HCl₂滴即成。

3.6.1.2.9 3％琼脂的配制：

取琼脂3克，加水100mL，加热煮沸至透明，加入1％的溴甲酚紫指示剂1－2滴。

3.6.1.2.10 0.85%生理盐水。

3.6.1.2.11 小牛血清。

3.6.1.3实验步骤

3.6.1.3.1小鼠巨噬细胞的激活:实验前4天给每只小鼠腹腔注射2%压积羊血红细胞0.2mL。

3.6.1.3.2巨噬细胞的收集：用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液4mL/只，轻轻按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬细胞，然后将腹壁剪开一个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液2mL于试管内（或用注射器）。

3.6.1.3.3滴片：用1mL加样器吸取腹腔洗液0.5mL加入盛有0.5mL 1％鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。用注射器（装大针头）吸取0.5mL混合液，加入玻片的琼脂圈内。

3.6.1.3.4孵育：放置孵箱内37℃孵育15－20分钟。

3.6.1.3.5孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1分钟，Giemsa液染色15分钟。

3.6.1.3.6用蒸馏水冲洗干净，晾干，用40×显微镜计数吞噬率和吞噬指数。吞噬率为每100个巨噬细胞中，吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分率；吞噬指数为平均每个巨噬细胞吞噬鸡红细胞的个数。

3.6.1.4 数据处理及结果判定

见3.6.2.4.

3.6.1.5注意事项

3.6.1.5.1颈椎脱臼处死小鼠勿用力过大，防止腹腔内血管破裂出血影响实验结果。

3.6.1.5.2放滴片的搪瓷盘内应保持一定的湿度，以防液体干燥。

3.6.1.5.3.孵育后的标本冲洗次数的差别不宜太大，更不要直接冲在有细胞的部分。

3.6.1.5.4.实验操作过程中应严格掌握时间。

3.6.1.5.5.在镜下计数细胞时要数完一个视野后再换另一个视野。