3.小鼠骨髓细胞微核实验

3.1 原理

骨髓细胞微核数增高是一次性全身γ射线照射引起辐射损伤的表现之一，在一定范围内，照射剂量与骨髓细胞微核率成正比，恢复时间与骨髓细胞微核率成反比，骨髓细胞微核数可代表机体染色体受损的状况。具有辐射危害辅助保护作用的受试物对受辐射损伤机体的遗传系统具有防护作用。

3.2 仪器和试剂

解剖器械，生物显微镜，载玻片等。

小牛血清：小牛血清滤菌后放入56℃恒温水浴保温1h进行补体活性灭活。－20℃保存。亦可用大、小鼠血清代替。

Giemsa染液及应用液

1/15mol/L磷酸盐缓冲液（PH6.8）

甲醇（分析纯）

3.3 实验方法

3.3.1 实验动物：小鼠，体重18－22g，单一性别，每组10－15只。

3.3.2剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予14－30天，照射后仍然给予受试物，必要时可适当延长至45天。

3.3.3 实验步骤：

受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量宜选择3Gy－5Gy。于照射后第3天，颈椎脱臼处死动物，取胸骨或股骨，用止血钳挤出骨髓液与玻片一端的小牛血清混匀，常规涂片。或用小牛血清冲洗股骨骨髓腔制成细胞悬液涂片，涂片自然干燥后，放入甲醇中固定5－10min，放入Giemsa应用液中，染色10－15min，立即用磷酸盐缓冲液或蒸馏水冲洗，晾干。镜检，每只动物计数1000个嗜多染红细胞中微核细胞数，微核率以千分率表示。

抑制率计算：
             C－D

A（％）＝────── ×100％

             C－E

式中 A－抑制率

     C－致突变物对照组微核率

     D－受试样品组微核率

     E －阴性对照组微核率

3.4 数据处理及结果判定

采用卡方检验、泊松分布或方差分析等统计方法进行数据处理。

辐射模型对照组与阴性对照组骨髓细胞微核率进行两样本均数的成组双侧t或t’检验，差异具有显著性，则判定辐射损伤模型成立。

任一剂量组微核率低于辐射模型对照组微核率，差异有显著性，可判定该实验结果阳性。

 

4.血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性实验

4.1 原理

血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性降低是一次性全身γ射线照射引起辐射损伤的表现之一，在一定范围内，照射剂量与血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性成反比，恢复时间与血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性成正比，血／组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性可代表机体氧化还原反应系统受损的状况。具有辐射危害辅助保护作用的受试物对受辐射损伤机体的氧化还原系统具有防护作用。

O₂^－氧化羟基的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈现紫红色，在波长530nm处有极大吸收峰，可用分光光度法进行测定，当SOD消除O₂^－后形成的亚硝酸盐减少。

4.2仪器与试剂

仪器  721分光光度计、离心机、恒温水浴、匀浆器

试剂

    65mM磷酸盐缓冲液(PBS) pH7.8、SOD标准品、三氯甲烷、95％乙醇(v/v)、0.9%生理盐水

10mmol/L盐酸羟胺

         盐酸羟胺6.95mg，加PBS至10mL

7.5mmol/L黄嘌呤

         黄嘌呤11.41mg，加0.1M NaOH 2.5mL溶解，加PBS至10mL

0.2mg/mL黄嘌呤氧化酶

         取10mg/mL黄嘌呤氧化酶0.2mL加冰冷PBS 9.8mL至10mL

0.1%甲萘胺

取0.2gα-甲萘胺溶于40mL沸蒸馏水，凉至室温加50mL冰醋酸，再加110mL凉蒸馏水至200mL

0.33%对氨基苯磺酸

取0.66g对氨基苯磺酸溶于150mL温蒸馏水，加50mL冰醋酸至200mL

4.3 实验方法

4.3.1 实验动物：小鼠，体重18－22g，单一性别，每组10－15只。

4.3.2剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个辐射模型对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品于照射前给予14－30天，照射后仍然给予受试物，必要时可适当延长至45天。

4.3.3实验步骤

受试样品组于照射前后经口连续给予受试样品，剂量组与辐射模型对照组均以同一剂量γ射线全身照射一次，照射剂量宜选择6Gy－8Gy。于照射后第7天，进行实验.

4.3.3.1红细胞抽提液制备：10μl全血冲入0.5mL生理盐水，2000r/min离心3min，弃上清，加冰冷的双蒸水0.2mL混匀，加入95％乙醇0.1mL，振荡30s，加入三氯甲烷0.1mL，置快速混合器抽提1min，4000r/min离心3min，分层，上层为SOD抽提液，中层为血红蛋白沉淀物，下层为三氯甲烷，记录上清液体积待测。

4.3.3.2组织匀浆的制备：剪取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，至玻璃匀浆器中加入冷生理盐水20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行三次，制成1％组织匀浆，（最好用超声波发生器处理30s），使线粒体振破，以中性红－詹钠氏绿B染色证明线粒体已振碎。以4000r/min离心5min，取上清液20μl待测。

4.3.3.3 SOD标准抑制曲线  将SOD标准品用磷酸盐缓冲液配制成750U/mL的溶液，再稀释到50倍，即SOD量为15U/mL（1.5μg/mL），用本法测定不同量的SOD标准液的百分抑制率，以百分抑制率为纵坐标，以SOD活力单位U/mL为横坐标绘制标准曲线。

                 对照管OD－测定管OD

SOD百分抑制率＝─────────────×100％

                     对照管OD

   

计算

每mL反应液中SOD抑制率达50％时所对应的SOD量为一个单位。

            (对照管OD-测定管OD)  ×100％

                对照管OD                 反应液总量(6mL)

SOD活力(U/mL)＝────────────×─────────×样品稀释倍数

                        50％                     取液量

 

也可用酶比活法即以每管样品的百分抑制率从SOD标准曲线查出相应的SOD U/mL，乘以稀释倍数(1mL/取样量)。

    若样品为组织匀浆液，根据匀浆浓度或组织蛋白质含量，将单位换算为U/g组织或U/mg蛋白。若样品为红细胞抽提液，根据血红蛋白含量，可换算为U/g Hb。